大型放射光施設 SPring-8

公開日

2018年01月15日

東京大学
大阪大学

発表のポイント：
◆DNA２本鎖の切断を修復するために必要なタンパク質RNF168^（注1）がDNA 損傷部位に集まる仕組みを明らかにしました。
◆RNF168 が複数の機能ユニットを利用してDNA 損傷部位の目印となるユビキチン鎖^（注２）を認識する分子機構を明らかにしました。
◆本成果は、DNA２本鎖切断の修復で重要な一過程の分子機構を明らかにしたもので、細胞のがん化や放射線感受性を抑えるための基盤となる知見になると期待されます。

【研究の背景】
　最も重篤なDNA 損傷の一つであるDNA２本鎖の切断は複数の反応過程を経て修復されます。DNA は通常、四種類のコアヒストンタンパク質が二つずつ入ったヒストン八量体に巻きついた状態で存在します。ヒストン八量体とそれに巻きついたDNA を一単位とした構造をヌクレオソームと呼び、ヌクレオソームが数珠状につらなった構造をクロマチンと呼びます。DNA２本鎖切断の修復過程では、切断部位周辺のクロマチンでリン酸化が起き、次に、シグナルタンパク質であるユビキチンが付加（ユビキチン化）された後に、それを目印として53BP1 やBRCA1 といった修復タンパク質が集積してくることがわかっています（図1）。ユビキチンは、自身にユビキチンが付加することで数珠つなぎの鎖（ユビキチン鎖）を形成して機能する例が多く知られていますが、DNA２本鎖切断の修復過程でもユビキチン鎖が形成されます。DNA２本鎖切断の修復過程での損傷クロマチンのユビキチン化では、ユビキチン付加酵素であるRNF168 が必須な役割を担い、53BP1 やBRCA1 に加えてRNF168 自身もユビキチン鎖を目印として集積することがわかっていました。RNF168 には、ユビキチンと結合する領域が複数知られていますが、それらのうちどの領域がどのようにユビキチン単独あるいはユビキチン鎖と結合するのか、また、どう使い分けがなされているのかは不明でした。

【研究内容】
　これまでの研究により、損傷クロマチンの目印として63 番目のリジン残基（K63）を介してつながったユビキチン鎖（K63 鎖）が必要であることがわかっています。研究グループは、RNF168 に含まれる既知のユビキチン結合ドメインに着目して、複数の生物種間でのアミノ酸配列の保存性も考慮に入れながら、精製タンパクの結合実験により、K63 鎖選択的な結合に必要な領域を探りました。その結果、アミノ末端側に存在するUDM1 と呼ぶ領域とカルボキシ末端側に存在するUDM2 と呼ぶ二つの領域にK63 鎖選択的な結合に必要な機能ユニットを同定しました。

　UDM1 には、UMI とMIU1 という二つの直列したユビキチン結合ユニットが知られており、これまでは、この二つの結合ユニットが協働してK63 鎖と選択的に結合すると考えられてきました。今回、研究グループの解析により、MIU1 はK63 鎖選択的な結合には不要であり、むしろ、UMI のN 末端側に存在するLRMと呼ばれるユニットがUMI と協働してK63鎖と選択的に結合することが新たに判明しました。一方、UDM2 は K63 鎖に選択的に結合するにも関わらず、MIU2 というユビキチン結合ユニットのみではK63 鎖への選択性はないことがわかっていました。本研究において、研究グループは、UAD と名付けた新たなユニットがMIU2 と協働してK63 鎖選択的に結合することを新たに見出しました。

　さらに、大型放射光施設SPring-8（兵庫県佐用郡）の高輝度X 線を利用してUDM1 およびUDM2 とK63 鎖との複合体の結晶構造を解析し、UDM1 中のLRM–UMI およびUDM2 中のUAD–MIU2 がK63 鎖と相互作用する様子を高解像度で明らかにしました。また、ヒト由来細胞株を用いた実験により、ユビキチン鎖との結合に必要なドメインの変異体はDNA 損傷部位に蓄積しないことが示され、タンパク結合実験の結果や決定した立体構造が、生きた細胞でも当てはまることが実証されました。

【社会的意義と今後の予定】
　RNF168 は、K63 鎖と相互作用するだけではなく、ヒストンタンパク質とも相互作用することが示唆されていますが、その詳細な仕組みはわかっていません。また、RNF168 が触媒するヒストンのユビキチン化反応とK63 鎖との結合の関連や、もう一つの重要なユビキチン付加酵素であるRNF8 との機能的役割の違いなども立体構造に基づいた理解は明確にされていません。今後は、損傷クロマチン上でのRNF168 の立体構造を知ることで、ヒストンのユビキチン化の反応状態を明らかにする研究が必要です。

用語解説
（注１）RNF168：
DNA２本鎖切断の修復に必須なタンパク質の一つ。DNA 損傷部位の目印となるユビキチン（酵母からヒトまで保存された小さな球状タンパク質。シグナル分子として多様な細胞機能を制御する）を付加する酵素活性を持つ。

（注２）ユビキチン鎖：
ユビキチンは、基本的に標的タンパク質の特定のリジン残基に共有結合を介して付加される。ユビキチン自身も標的タンパク質の一つであり、ユビキチン同士が結合して数珠つなぎになったものをユビキチン鎖と呼ぶ