大型放射光施設 SPring-8

公開日

2021年05月18日

2021年5月18日
兵庫県立大学
理化学研究所
広島市立大学

背景
　亜酸化窒素（N₂O: Nitrous Oxide）は別名笑気（Laughing Gas）とも呼ばれ、麻酔にも使われる非常に安定な気体です。しかしその安定性ゆえに、発生すると地球の大気中に拡散し、太陽光に含まれる赤外線を吸収するので、温室効果ガスとなります。地球上のN₂O発生量は、温室効果ガスとしてよく知られる二酸化炭素CO₂の数千分の一程度ですが、その温室効果はCO₂の約310倍であり、地球温暖化の観点から無視できません^{（文献1）}。さらに厄介なことに、N₂Oが地球の大気圏の外である成層圏にまで拡散すると、紫外線などにより窒素酸化物（NO_x）に変化します。NO_xは非常に反応性に富み、地球を取り囲むオゾン層を破壊します。1970年代にオゾン層破壊の原因物質としてフロンが注目され、その使用が規制されて以降、N₂Oがオゾン層破壊の主要因となっています^{（文献2）}。このように、N₂Oは21世紀の地球環境保全を考える上で鍵となる気体の一つと指摘されてきました。
　N₂Oは、工場や車の排ガスや燃焼ガス、動物の糞尿などからも発生しますが、N₂O発生の75%以上は農業が原因と言われています^{（文献3）}。肥料として播く窒素化合物を、土壌中のカビや細菌などの微生物が分解する過程でN₂Oが産生されるためです。このような生物的過程を「脱窒（Denitrification）」といいます。脱窒は土壌中など酸素の無い環境に生息する微生物の嫌気呼吸の一種で、硝酸イオン（NO_3^-）や亜硝酸イオン（NO_2^-）が逐次分解される過程です（NO_3^- → NO_2^- → NO → N₂O → N₂）。脱窒の中間生成物として産生されるN₂Oが大気中に漏れ出ることになります。脱窒の各ステップは微生物が持つ金属酵素によって触媒されていますが、最終過程（N₂O → N2）を触媒する金属酵素を持たない微生物もあり、その場合はN₂Oが最終産物となります。
　N₂O発生、すなわち一酸化窒素（NO: Nitric Oxide）をN₂Oに変換する過程は、鉄（Fe）を活性中心に含む酵素である一酸化窒素還元酵素（NOR: Nitric Oxide Reductase）によって触媒されます。この酵素反応は、2NO + 2H⁺ + 2e^- → N₂O + H₂O です。NOは非常に反応性の高い気体であり、微生物の体内に留まると微生物自身が死滅してしまうので、脱窒の中間生成物として作られるNOを速やかにN₂Oに変換し無毒化するNORは、脱窒を行う微生物にとって無くてはならない酵素です。
　本研究で研究対象にした脱窒カビFusarium oxysporumのNORについては、約40年前に筑波大学の祥雲弘文助教授（現在、東京大学名誉教授）が発見し、25年前に本研究の主著者の一人である城教授が、当時の計測技術を駆使して、そのN₂O産生機構のアウトラインを提案しました（図1）。この酵素反応中には数百ミリ秒という非常に短時間だけ反応中間体が現れます。N₂Oが産生されるメカニズムを確定する上で非常に重要であるとの認識から、この25年間、この反応中間体の構造と電子状態は世界中で研究されてきました。これまでに4つの可能性が提案されていましたが（図1）、既存の測定技術では、その構造を確定できる決め手がありませんでした。

研究手法と成果
　NORの反応中間体のように非常に短寿命な状態の構造・電子状態を決定するためには、実際に反応している最中の酵素を観測しなければなりませんでした。そのために共同研究グループは、紫外光を照射するとNOを放出するケージド化合物^（注4）を反応開始剤として利用し、その直後に現れる反応中間体の構造解析にX線自由電子レーザーSACLAを光源とした無損傷X線結晶構造解析法を、電子状態の解析には時分割赤外分光法を用いました。
　まず、酵素反応前のNORの結晶に紫外光を照射し、目的の反応中間体が現れた瞬間にそれを瞬時に凍結する装置を開発することで、NORの反応中間体を結晶状態で捉えることに成功しました。この反応中間体の結晶を用いて、SACLAの最先端技術、すなわち反応性の高い不安定な構造を無損傷で解析した結果、反応開始前は直線状だったNOの鉄（Fe）への配位構造（∠Fe-N-O = 158°）は、反応中間体では大きく折れ曲がった特殊な構造（∠Fe-N-O = 138°）へと変化していることが判明しました（図2）。
　一方、短寿命の反応中間体の電子状態の測定は、従来の赤外分光装置では全く困難でした。そこで、これを可能とするために、共同研究グループは、フェムト秒赤外パルスレーザーを光源とする分光装置と、マイクロ流路デバイスを組み合わせることで、NORの酵素反応を連続的に追跡できる新しい時分割赤外分光装置を開発しました。この独自開発した装置によって、世界で初めてNOR反応の短寿命反応中間体の赤外分光スペクトルを得ることに成功しました。このスペクトルデータを詳細に解析し、前述の構造データと合わせて、さらに量子化学計算を併用することで、遂にNORの反応中間体の電子状態が、今まで提案されていた4つの状態の中の『Fe³⁺-NHO^•-』であることを明らかにしました（図2）。この状態は非常に反応性に富む不対電子をもったラジカル状態^（注5）であるため、もう1分子のNOと速やかに反応することができ、それによりN₂Oが産生されるメカニズムを確定できました。この研究により、25年間未解決だった生物的N₂O発生の分子機構の解明に終止符が打たれたことになります。

本成果の意義
　冒頭で述べた通り、N₂Oは今後の地球環境を考える上で非常に重要な気体です。本成果は、微生物によるN₂Oの排出量を抑制する上で重要な分子基盤になると考えられます。また、本研究で開発した測定技術は、さまざまなケージド化合物と酵素の組み合わせに適用することが可能であり、高い機能をもつ生体触媒のしくみの理解など、今後の幅広い展開が期待されます。

　本研究は、科研費助成事業の基盤研究(S)「一酸化窒素の生体内動態の分子科学」、新学術領域研究(研究領域提案型)「生命金属動態に関与するタンパク質分子の構造機能ダイナミクス研究」、「時間分解構造解析を補完する精密顕微分光計測」、学術変革領域(A)「大規模・高精度な第一原理計算による超秩序構造の機能解明とデザイン」、理化学研究所Pioneering Project「動的構造生物学」などの支援を受けて実施されました。

用語解説

参考文献