大型放射光施設 SPring-8

公開日

2023年07月21日

2023年7月21日
国立大学法人東北大学
国立研究開発法人理化学研究所

【発表のポイント】
⚫︎ サブピコ秒^（注1）（1ピコ秒は1兆分の1秒）という極めて短時間で起こる蛍光タンパク質の動きの可視化に成功しました。
⚫︎ 蛍光タンパク質の光受容部がねじれながら構造変化する仕組みを解明しました。
⚫︎ 蛍光タンパク質を利用した超解像顕微鏡による観察技術の促進につながることが期待されます。

【研究の背景】
　蛍光タンパク質は特定の波長の光を吸収して蛍光を発するタンパク質であり、2008年のノーベル化学賞の受賞対象としても注目を集めました。遺伝子組換え操作により、蛍光タンパク質を連結させたタンパク質を細胞内に発現させ、光を当てると、生きた細胞内においてタンパク質分子の位置や挙動を直接観察することが可能となり、生命現象の理解が飛躍的に向上しました。このような生体イメージングに利用される蛍光タンパク質は、これまでに様々なタイプがデザインされており、光の照射によって蛍光性のオン-オフを制御できる光スイッチ型の蛍光タンパク質も開発されてきました。蛍光タンパク質による光スイッチは、発色団の光によるシス-トランス異性化によって起こります。この異性化の方法としては、発色団分子が1つの結合軸の周りに回転するone-bond-flip機構^（注2）と2つの結合軸の周りの回転によりねじれを伴うhula twist機構^（注3）の2つの可能性があります（図1(a)）。しかし、発色団の多くは対称な分子構造を有しており、どちらの機構で構造変化が起こったか区別がつかないことに加え、光照射による発色団の構造変化は極めて早く起こることからその動きを捉えることは困難でした。

【研究手法】
　蛍光タンパク質が構造変化する過程に残された謎を解き明かすために、研究グループはポンプ・プローブ法^（注4）とシリアルフェムト秒結晶構造解析（SFX）^（注5）の手法を組み合わせた実験により、タンパク質の動きをタイムラプス撮影の要領で“分子動画”として捉えることを目指しました。研究グループはまず2種類のスイッチ機構を区別するために、遺伝子組換え操作により、光スイッチ型蛍光タンパク質rsEGFP2の発色団に対称性を崩す置換基を導入しました（図1(b)）。
　次に、改変型rsEGFP2の結晶を作成し、ポンプ・プローブ型SFX用の実験装置がある日本のX線自由電子レーザー（XFEL）施設SACLAにて測定を行いました。具体的には可視光を結晶に照射することで光異性化をスタートさせ、300 fs、600 fs、900 fs、5 ps、100 ps、1 μs経過した後にXFELを照射しました。そして、各時間において収集した実験データを元にrsEGFP2の立体構造を決定し、時間経過の順に並べることで構造変化を動画として捉えました。

【研究成果】
　光照射前後の構造を比べると、光を照射してから100 ps〜1 μs経過した時点で発色団の構造変化が観測されました（図2）。発色団の構造から、rsEGFP2の光スイッチ過程はhula twist機構によって進行することが明らかになりました。より早い600 fs〜900 fs経過した時点では、発色団のねじれた構造を捉えることができました（図2）。この結果は、発色団の分子構造がねじれながら変化するhula twist機構を直接観察した初めての例となりました。

【今後の展望】
　光スイッチ型蛍光タンパク質の構造変化を視覚的に捉えたことで、30年以上前に提唱されたにもかかわらず、詳細なメカニズムが不明であったhula twist機構を立証することができました。本研究成果により得られた構造情報は、新たな蛍光タンパク質を合理的に設計するための指針となる重要な知見であり、蛍光タンパク質を用いた超解像顕微鏡^（注6）技術や細胞機能の発現制御技術の発展に貢献することが期待されます。

【謝辞】
　本研究は、日本学術振興会（JSPS）科学研究費助成事業新学術領域研究「高速分子動画法によるタンパク質非平衡状態構造解析と分子制御への応用（領域代表：岩田想）」（JP19H05776）、日本医療研究開発機構（AMED）創薬等ライフサイエンス研究支援基盤事業創薬等先端技術支援基盤プラットフォーム（BINDS）「創薬等ライフサイエンス研究のための相関構造解析プラットフォームによる支援と高度化（SPring-8/SACLAにおけるタンパク質立体構造解析の支援および高度化）（研究代表者：山本雅貴）」（JP21am0101070）による助成を受けて行われました。

【用語説明】