SPring-8, the large synchrotron radiation facility

Inquiry number

SOL-0000001633

Beamline

BL41XU (Macromolecular Crystallography I)

Scientific keywords

A. Sample category	biology, medicine
B. Sample category (detail)	biomolecule, crystal, protein, pharmaceuticals
C. Technique	X-ray diffraction
D. Technique (detail)	single crystal, MAD
E. Particular condition	low-T (~ liquid N2)
F. Photon energy	X-ray (4-40 keV)
G. Target information	chemical state, chemical bonding, structure analysis, function and structure

Industrial keywords

level 1---Application area	Pharmaceuticals
level 2---Target	drug design, process analytical technology (PAT)
level 3---Target (detail)	protein, drug
level 4---Obtainable information	crystal structure, local structure
level 5---Technique	diffraction, X-ray diffraction

Classification

M10.10 single crystal diffraction

Body text

多波長異常分散（MAD）法は、結晶を構成する分子が重原子を有している場合、１つの試料結晶から位相情報を得ることの出来るとても強力な手法です。

通常、タンパク質分子は炭素・窒素や酸素などの軽原子ばかりで構成されているので、ＭＡＤ法を適用するにあたっては、重原子をタンパク質分子に後から添加する必要があります。しかし、目的タンパク質を「セレノメチオニン化」タンパク質として得ることが出来れば、タンパク質分子中にセレンを先天的に含むため重原子の添加作業がいらず、大幅な解析効率の向上に繋がります。

本事例では、セレノメチオニン化したラット由来ヘムオキシゲナーゼ-１の立体構造を、セレンを用いたMAD測定によって決定しました。この酵素はタンパク質１分子中に８残基のメチオニンを含むのですが、その全てをセレノメチオニン化したものは結晶化条件の安定性などに問題があったため、４残基は別アミノ酸に置換して、残り４残基のメチオニンをセレノメチオニン化してあります。

この結果から、ヒト由来の同酵素との基質反応性の違いなどを立体構造に基づいて議論することが可能となりました(図１)。

図１. ヘムオキシゲナーゼ-１(ラット由来：緑、ヒト由来の閉状態：青、赤：ヒト由来の開状態)のステレオ図

[ M. Sugishima, Y. Omata, Y. Kakuta, H. Sakamoto, M. Noguchi and K. Fukuyama, FEBS Letters 471, 61-66 (2000), Fig. 4,
©2000 Federation of European Biochemical Societies ]

Source of the figure

Original paper/Journal article

Journal title

M. Sugishima, et al., FEBS Lett. 471(1), 61-66, Apr. 7 (2000)

Figure No.

4

Technique

多波長異常分散（MAD）法は、結晶を構成する分子に結合した重原子のX線吸収端近傍の複数の波長でX線回折像を測定することです。これらの回折像の比較・解析から結晶の位相情報を求めて、分子の立体構造を得ることが出来ます。

しかし、タンパク質分子は炭素・窒素や酸素などの軽原子ばかりで構成されていることがほとんどで、ＭＡＤ法に必要な重原子は試料タンパク質を結晶化した後に人為的に付加する必要があります。タンパク質分子にうまく結合する重原子種の探索や、付加条件の検討などに多くの時間と労力が費やされます。

タンパク質を構成するアミノ酸の１つに「メチオニン」というものがあります。また、その硫黄原子をセレンに置換した「セレノメチオニン」というものを化学合成することが出来ます。目的のタンパク質を発現させる宿主にメチオニンを生合成できない大腸菌を選び、その生育培地からメチオニンを除去した上で代わりにセレノメチオニンを加えておくと、目的のタンパク質を含む、この大腸菌の発現する全てのタンパク質中のメチオニンがセレノメチオニンに置換されます。この「セレノメチオニン化」タンパク質は先天的にセレンという重原子を含んでいるので、ＭＡＤ法を適用する際に重原子種の探索や付加条件の検討といったステップは不必要になります。

Source of the figure

No figure

Required time for experimental setup

0 hour(s)

Instruments

Instrument	Purpose	Performance
タンパク質結晶用回折装置	Ｘ線回折像の記録
ペルチェ冷却型Si-PINフォトダイオード	Ｘ線吸収スペクトルの測定

References

Document name
M. Sugishima, et al., FEBS Lett. 471(1), 61-66, Apr. 7 (2000)

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Questionnaire

This solution is an application of a main instrument of the beamline.
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Ease of measurement

Middle

Ease of analysis

Middle

How many shifts were needed for taking whole data in the figure?

Two-three shifts