大型放射光施設 SPring-8

公開日

2007年07月15日

平成19年7月16日
独立行政法人理化学研究所
米国ハーバード大学ブリガム婦人病院

本研究成果のポイント
● 「ロイコトリエンC4合成酵素」そのものや産生開始の状況を結晶化し解析
● “酵素”が3つで正三角形を作り、隙間のV字空間が触媒機能を生み出す
● 構造解析をもとに薬の候補になる新たな合成阻害分子のデザインも

１．背　景
　喘息や炎症を引き起こす生理活性物質LTC₄とその代謝物（LTD₄ 、LTE₄）は、生体内に存在するアラキドン酸を出発原料に、さまざまな反応を繰り返し、５-リポオキシゲナーゼの経路を介して産出される脂質メディエーターです（図１）。LTC₄、LTD₄ 、LTE₄（図１）は、総称してシステイニルロイコトリエン（Cys-LT）と呼ばれ、体内に抗原（アレルゲン）が入り込むと、免疫、炎症に関わる細胞にIgEというタンパク質が結合して抗原抗体反応^※８の後に放出される化学物質です。このCys-LTは、特異的な受容体に結合することで、肺の気管支収縮や毛細血管の膜透過性の亢進、粘液の分泌を増加させます。これらの反応は、抗原が体内に入るとすぐに始まり、アレルギー性鼻炎（花粉症）や気管支喘息の症状を引き起こすことになりますが、さらに反応が過剰に進むとアナフィラキシーショックという重篤な病態を引き起します。Cys-LTは、1960年代に、同じく肺の気管支収縮活性を示すヒスタミンより1,000倍強く、長時間続く活性があることから、アナフィラキシー遅延反応性物質（SRS-A）とも呼ばれていました。その後、スウェーデンのベンクト•サムエルソンらが、SRS-A（Cys-LT）の化学構造が、一つの分子中に４つの二重結合を持つ脂肪酸と、アミノ酸が３つつながったトリペプチドであるグルタチオンが結合したものであることを明らかにして、1982年にノーベル生理学•医学賞を受賞しました。
　Cys-LTの一部の働きを阻害する物質が、これらの諸反応を抑制することから、喘息やアレルギー治療薬に用いられています。金岡、オースティンらが作製したLTC₄Sの遺伝子を欠損させたネズミを使った種々の炎症モデル実験では、現在用いられている阻害薬では説明できないCys-LTの生体内での免疫および炎症反応における役割が明らかになっています。このことはLTC₄Sの阻害薬が、新たな喘息、アレルギーの治療薬となる可能性を示唆します。しかし、免疫反応の重要な役割を果たすLTC₄Sの働きやその反応の実態については謎のままでした。

図１　LTC₄の生合成経路
5-HpETE（5-hydroperoxy eicosa tetraenoic acid）: 5−ヒドロ・ペルオキシ・イコサ・テトラエン酸、Glu: グルタミン酸、Cys: システイン、Gly: グリシン。

２．研究手法
　研究グループは、LTC₄を作る酵素であるLTC₄Sの立体構造を、原子レベルで明らかにするために、分裂酵母（Schizosaccharomyces pombe）で遺伝子工学の手法を用いて、生体内とまったく同じ姿をしたLTC₄Sを発現させました。さらに、LTC₄Sの触媒機能を詳しく調べるために、解析には、LTC₄産出に必要なグルタチオンを含んだ、反応がある程度進んだ状態の結晶を作り、X線結晶構造解析によってその構造を明らかにしました。大型放射光施設（SPring-8）の理研構造生物学IIビームラインBL44B2を使って、LTC₄Sの立体構造を3.3 Å（オングストローム＝10^-10m）の精度で測定し、構造を決定しました。

３．研究成果
　ヒト由来LTC₄Sの結晶構造を、基質であるグルタチオンとの複合体として3.3 Åの精度で決定しました。その結果、LTC₄Sの三次構造は、５本のα-ヘリックスからなり、初めの４つのα-へリックスが膜貫通α-へリックス束を形成した後、５本目のα-へリックスが続く構造となっていました。LTC₄Sが酵素として機能するためには、４回膜貫通型タンパク質であるLTC₄Sが、3分子集まり、正三角形の頂点を基点としたような構造をつくり（図２）、その隣り合う２つのLTC₄Sの間に角度が30度のV字型の空間を作っていました。また、LTC₄の一部になるグルタチオンはU字型の構造をとり、V字型の空間に深く埋まって結合していました（図３）。LTC₄Sが酵素として機能するためのグルタチオンの結合様式（図２）は、今まで報告されたグルタチオンの代謝に関係する他の酵素には、見られないものでした。さらに、LTC₄Sの働きに関わる複数のアミノ酸残基が遺伝子工学的手法により示唆されていましたが、それらはすべてこのV字型の空間に面していることもわかりました（図３）。
　以上の点から、グルタチオンとLTA₄からLTC₄が作られる場所（触媒活性部位）は、隣り合う２つの単量体LTC₄Sの間に存在するV字型の空間（図３）であることがわかりました。このことは、LTC₄に似た形をして触媒機能を抑えるS-ヘキシルグルタチオンを加えた結晶を解析し、この反応を阻害する様子も明らかにすることで、さらに支持されました（図４）。研究グループは、この複合体モデル構造から、「グルタチオン近傍に存在し、それぞれ隣り合う２つの酵素から提供される異なる２つのアルギニン残基がLTC₄産生に重要である」という全く新しい分子メカニズムを提案しました（図５）。

図２　ヒト由来LTC4Sの全体構造
LTC₄S（紫、水、黄緑色）は５本のα-ヘリックスのみで構成されていた。 LTC₄Sは正三角形の頂点になるようにぐるりと３分子集まって酵素として機能する。赤紫色はグルタチオン。

図３ U字型のグルタチオン
グルタチオン（図中央部分：緑色）近傍に存在するさまざまなアミノ酸の相互作用によってU字型が安定していた。

図４　活性部位に結合したS-ヘキシルグルタチオン
活性部位にはLTC₄に似た形をしたS-ヘキシルグルタチオンが結合していた。（白と黒の部分がLTC₄S）

図５　基質LTA₄（図中央部分：水色）がLTC₄Sの活性部位に結合したモデル
グルタチオン（図中央部分）近傍に存在し、隣り合う酵素からそれぞれ供される２つのアルギニン残基（R31とR104）がLTC₄を産生するという、全く新しい分子メカニズムを提案した。

４．今後の期待
　LTC₄Sは、アミノ酸配列の類似性から、膜に結合するエイコサノイドとグルタチオンの代謝に関係するタンパク質の一群に属しています。その一群は、英語名（Membrane-Associated Proteins in Eicosanoid and Glutathione metabolism）の頭文字をとって「MAPEG superfamily」と呼ばれています。これらの中には、生体内で最も豊富に産出される生理活性脂質プロスタノイド^※９の1種であるプロスタグランジンE₂（PGE₂）の産生に関わる酵素（MPGES-1）も含まれており、PGE₂もまた、生命機能において子宮収縮、発熱などの重要な役割を担っています。このタンパク質の一群に属するLTC₄S で見いだした、グルタチオンの結合様式と基質結合部位の新発見は、MPGES-1を含む「MAPEG superfamily」に属する酵素の働きを理解することに大きく寄与します。また、LTC₄Sは、炎症•免疫における強い病理や生理反応を引き起こすSRS-A生合成のキー酵素であるため、例えば花粉症、慢性喘息など、未だ十分な薬が無い慢性アレルギー疾患に対する、新たな作用機序を持つ抗炎症•抗アレルギー創薬につながる可能性があります。

＜用語解説＞

※１　膜貫通型タンパク質
　細胞の脂質二重膜を貫通する形で結合しているタンパク質の総称。過去にSPring-8において構造決定された、ウシ由来ロドプシンやウサギ由来カルシウムポンプは、このカテゴリーに入る。

※２　脂質メディエーター
　生理活性脂質のうち生体内で生産され、細胞外に放出された後に他の細胞上にある細胞膜受容体に結合することによって作用する脂質。反応などを仲介、伝達しているように見えることからメディエーターの名が付いた。

※３　グルタチオン
　天然には動物、酵母その他ほとんどの生体細胞中に含まれ、きわめて重要な役割を果たす。アミノ酸が３つ（グルタミン酸、システイン、グリシン）繋がったトリペプチドである。

※４　アナフィラキシー
　生体の免疫応答反応のひとつで、IgEというタンパク質が関与する。あらかじめ適当な抗原を注射しておいた動物に、再び同じ抗原を注射すると、その動物が激しいショックを起こす症状をいう。

※５　アナフィラキシー遅延反応性物質（SRS-A）
　生体のアナフィラキシー免疫応答反応の際に、免疫や炎症に関与する細胞から、脂質メディエーターとして放出される化学物質。半世紀以上も前からその存在が知られており、肺の気管支や回腸を長時間にわたって収縮させる活性があることから、この名前が付いた。アナフィラキシー遅延反応性物質の英語表記である“Slow Reacting Substance of Anaphylaxis”の英語の頭文字をとってSRS-Aと呼ばれている。その後、スウェーデンの生理学者で、ノーベル医学生理学賞を受賞したベンクト•サムエルソンらによって、SRS-Aの構造が明らかにされ、後にロイコトリエンC4（LTC₄）と名づけられた。

※６　ヒスタミン
　ロイコトリエンと同様、体内で過剰に遊離するとアレルギーを引き起こすといわれている。市販の抗アレルギー薬の一部は、この物質を標的にしたものである。

※７　S-ヘキシルグルタチオン
　グルタチオンの硫黄原子に６つの炭化水素鎖が結合した、化学合成の物質。天然には存在しない。

※８　抗原抗体反応
　抗原（アレルゲン）と、これに対応する抗体とが結合して引き起こされる特異的反応。ヒトや動物の体内では、アレルギーの原因となる。

※９　プロスタノイド
ロイコトリエンと同様に、アラキドン酸から産生される。生体内で様々な生理機能を担うばかりでなく、発熱や痛み、炎症などの病状を引き起こすプロスタグランジンやスロンボキサンなどの脂質メディエーターの総称。