大型放射光施設 SPring-8

公開日

2007年02月19日

平成19年2月19日
独立行政法人科学技術振興機構(JST)
財団法人高輝度光科学研究センター(JASRI)

研究の背景
　免疫反応時に起こる、病原体等を認識しそれと結合して排除したり、受容体を介して非自己物質の存在を細胞内に伝達して、免疫細胞を活性化したりというような機能性生体高分子の機能が、どのような分子間相互作用によってなされているのかを詳細に理解するためには、その着目する分子内部の運動を実時間で、それも１個の分子に対して極めて高い位置決定精度で計測しなければなりません。それを実現できる方法にＸ線１分子追跡法(Diffracted X-ray Tracking: DXT)があります。DXT法は図１に示すように、標的となる分子に非常に結晶性の良いナノ結晶（直径15nm（ナノメートル＝10^-9メートル））１個を反射鏡代わりに標識し、そこにSPring-8から得られる強力な白色Ｘ線（放射光）を照射して得られるＸ線回折^（注４）（または反射）斑点を追跡することで、標的とする１分子内部の動きをピコメートル精度でかつミリ秒時分割で実時間計測できるという本研究グループが考案し実現した高精度１分子追跡法です。直接分子の運動を見ているわけではありませんが、水溶液のような高粘性条件下では、この標識したナノ結晶と標識されている生体分子の末端部位の運動はほぼ同様の運動であることが判ってきました。今まで、DNA分子、可溶性タンパク質分子、機能性膜タンパク質分子など多くの１分子動的挙動計測に成功しています。
　ブラウン運動は1827年にイギリスの植物学者ロバート・ブラウンによって水中における花粉の顕微鏡観察で発見されました。その後この現象は、当時注目されていたアインシュタインの分子運動論を証明することに利用されました。本研究において注目しているブラウン運動は、花粉のような身近な微粒子から１分子に至るまで共通の極めて重要な物理現象です。このブラウン運動を詳細に解析することは、機能性生体高分子の動的挙動を理解する上でも同様に重要です。今までの測定結果から、DXT法は分子全体のブラウン運動の計測だけではなく、１分子内部にある局部的なブラウン運動も計測可能であることが判ってきました。

研究成果の内容
　本研究グループでは、タンパク質１分子内の動的挙動を研究対象にしています。上記DXT法では個々の分子内運動を詳細に計測できます。そこで、生体分子間相互作用の前後において分子内運動がどのような規則で変化しているのか、本Ｘ線１分子追跡法(DXT)を用いて観察することにしました。
　本実験で利用したのは、免疫系の重要分子である抗体^（注２）（図２）です。抗体を選んだ理由はいくつかあります。例えば、抗原抗体反応と同じくらい生体反応で有名なものには、酵素基質反応がありますが、酵素が基質と結合すると酵素反応により基質を別の物質に変えて手放してしまうので、基質を結合した状態での酵素分子内運動を安定に観察することが、現状の計測スピードでは困難です。その点、抗体は、抗原と結合しても酵素反応のようなことは起きずに安定的に抗原抗体複合体を形成しているので観察できます。また同じ抗原に対してそれぞれ結合力の異なる一連の抗体を比較することで抗原に対する結合力と抗原結合に伴う抗体分子内運動の変化との相関関係を調べることにとても好都合でした。
　上記実験は、大型放射光施設（SPring-8）の理研構造生物学IIビームラインBL44B2で行ないました。検出器は、Ｘ線イメージインテンシファイヤー（蛍光増倍管）を使用し、数ミリ秒のＸ線パルスを用いて、2秒間で30ミリ秒積算の60回連続計測をおこないました。測定温度は20℃に設定してすべての実験を行ないました。抗原結合前と結合後の抗体Fab（抗原との結合部）領域の分子内運動を比較した結果を図３に示します。
　分子内ブラウン運動の評価は、平均二乗変位量(Mean-square Displacement：MSD)^（注５）と計測時間との相関によってなされます。その相関が直線で結ばれる時は（図４）通常の単純ブラウン運動、飽和曲線になると、ある拘束力が加わったブラウン運動。そして、放物線の関係になれば、一方向からの外力がブラウン運動に加わっていることを示します。この外力はＸ線１分子計測法ではＸ線からの放射圧であることが本研究グループの解析によって明らかにされています　（平成18年7月20日付プレス発表）。
　図３の結果を見ると、抗原を結合した抗体Fab断片は、抗原を結合していない時よりも、分子内運動量が小さくなり、プロットが放物線からより直線的な形になっていることから、Ｘ線の放射圧による力に対して堅くなっていることが分かりました。抗原抗体反応を代表とする分子間相互作用では、結合反応が起こると分子全体が安定化して、その運動特性も安定化し揺らぎ幅も小さくなるという予想は、以前から多分子系の研究で理論的にも実験的にもされていました。しかし、１分子でその事実を確認することは今まで成功していません。本研究では、DXT法により１分子レベルでの運動特性の安定化を確認することに世界で初めて成功しました。
　このMSDカーブから分子内ブラウン運動の大きさを示す係数（Ｄ）とＸ線の放射圧による力に対する抗体Ｆａｂ断片の柔らかさを示す係数（Ｖ）を算出し、抗原に対する結合力（Ｋａ）およびこれから算出されるギブス自由エネルギー変化（ΔG）^（注６）と共に表１にまとめました（ΔGとＫａとの間には、ΔG = -RTlnＫａ (R: 気体定数、T: 絶対温度)という関係式が成り立っています）。抗原結合によるＤ値、Ｖ値の減衰比を各抗体で比較してみるとＶ値は、４種類の抗体間でそれほど大きな差が見られないのに対し、Ｄ値は抗原に対する結合力に相関して減衰比が大きくなっていることに気づきました。そこで図５にてＤ値の減衰比とギブス自由エネルギー変化との関係を確認してみたところ、とても興味深いことに両者で比例関係が極めて良く成り立っていました。これは、１分子レベルで分子間の結合力を決定できることを示しています。
　本実験では、実験系を簡単にするために抗体Fab断片を用いましたが、同様の分子内運動の制御は、完全な形の抗体分子の時も起こることが予想され、抗原受容体のシグナル伝達機構をはじめとした抗体の機能との関連性を議論する上でも今後の研究に大きな期待が寄せられます。

今後の展開
　今後の実験としては、DNA-DNA結合蛋白質、ホルモン−ホルモン受容体など抗原抗体反応以外の生体分子間相互作用系でも、１分子レベルで分子間の結合力を決定できるかの確認をしなければなりません。一方、今回見られたような抗体の分子内ブラウン運動が、シグナル伝達をはじめとする抗体の機能とどのように関係しているかを明らかにする必要があります。このようなことが明らかになれば、将来は分子内ブラウン運動を制御することによる生体機能の制御ができるようになるかもしれません。
　また、抗原抗体反応をはじめとする生体分子間相互作用の解析は、生命現象の解明、医薬品やバイオセンサーなどの開発への基礎的な研究手法でありますが、従来の方法では計測手法や測定条件にもよりますが約10¹⁰〜の分子数を必要としていました（表２）。取り扱うサンプル系によっては、これだけの量を集めるのが非常に困難だったり、コストがかかってしまうことがありました。しかしながらDXT法を用いれば理論上１分子から分子間相互作用を解析することが可能であり、今後広域な関連分野に大きな影響を与えるものと予想されます。
　さらに現在、計測時間の高速化、ナノ結晶の形状の制御などの技術開発も行っていますが、これらが確立されれば生きた細胞内で起きている様々な生命現象を1分子レベルで、しかもリアルタイムで観測することも可能となるでしょう。
　また、同様の測定を電子顕微鏡ですることも、現在CREST「生命現象の解明と応用に資する新しい計測・分析基盤技術」領域（研究総括：柳田敏雄）において研究展開を進めています。よりコンパクトな装置構成での生体分子内運動の計測法は、放射光施設利用とは別の研究展開が可能になるでしょう。

＜参考資料＞

＜用語解説＞

（注１）　抗原
　抗体に特異的に結合できる物質のことを抗原と呼びます。ウイルスを構成している蛋白質や化学物質アレルギーの原因である低分子化合物まで大小問わず様々な物質が抗原になりうる可能性をもっています。本研究で用いた抗原はニトロフェニル基を持つ低分子化合物で、1960年代から用いられており、非常に良く研究されている抗原抗体反応系の一つです。

（注２）　抗体
　生体防御反応における主要な蛋白質成分の一つ。Ｙ字型をしており２カ所の抗原結合部位（図２抗体モデルの赤い箇所）で抗原と特異的に結合し、外来異物を排除します。研究用試薬や医薬品としても注目されており、多くの分野で基礎研究、応用研究が盛んに行われています。

（注３）　大型放射光施設（SPring-8（スプリング８））
　世界に3台ある第３世代大型放射光施設のうち、日本の播磨にある大型放射光施設の略称（Super Photon Ring 8 GeV)。この施設が利用できるようになって、生命科学から物質科学の極めて多くの分野のサイエンスが進歩しました。特に、生命科学の分野では、生体分子の原子レベルの構造情報を決定することに数多く成功しています。次のターゲットは細胞内で働いているその場での構造情報の取得です。

（注４）　Ｘ線回折
　電磁波の中でもＸ線は透過する能力が強く、通常の散乱する能力や反射率は高くありません。しかし、散乱体の結晶構造体の周期性とＸ線の周期性が一定の条件（ブラッグの条件）を満たした場合のみ反射率が高くなり、それがスポット（ラウエの斑点）として現れます。

（注５）　平均二乗変位量(Mean-Square Displacement：MSD)
運動の大きさを表す統計処理指標の１つ。ある決まった時間幅の中での運動の始点と終点の距離の自乗（運動の方向性を無視する）の総和量です。特に、ブラウン運動のような各時間内ではランダムな運動をしており、その総和的な解析でその特徴が現れる物理現象を取り扱う時に使われる解析因子です。

（注６）　ギブス自由エネルギー変化
　自由エネルギーとは、熱力学における状態量の一つであり、特に等温等圧過程の自由エネルギーは、ギブス自由エネルギーと呼ばれています。一般的にこの値が小さい方がより安定な状態を取っていると解釈されます。生体分子間相互作用では、結合前の状態に比べて結合後の状態の方が安定な状態と言えますので、結合反応が起きることでギブス自由エネルギーは、減少し、その変化量（ΔG）は、負の値を取ることになります。また結合力（Ka）とは、
　　　ΔG = -RTlnKa
という関係式で結びついています。ここで、Rは気体定数、Tは絶対温度を表しています。つまりある一定温度下で分子間相互作用を比較するとき、ΔGが負に大きな値であれば結合力が高い（Kaが大きい）ということになります。

＜研究領域等＞
この研究テーマを実施した研究領域、研究期間は以下の通りです。
○ 研究領域：たんぱく質の構造・機能と発現メカニズム
　　（研究総括：大島泰郎（共和化工株式会社　環境微生物学研究所　所長））
　　研究課題：X線１分子計測からのin-vivo蛋白質動的構造／機能解析
　　研究代表者：佐々木裕次（SPring-8/（財）高輝度光科学研究センター 主幹研究員）
　　研究期間：平成13年度〜平成18年度