大型放射光施設 SPring-8

公開日

2015年10月01日

2015年10月1日
京都大学
科学技術振興機構（ＪＳＴ）

ポイント
• 抗体を用いる独自の結晶化技術により、ヒト・哺乳類において糖分子を細胞内に輸送する膜たんぱく質の立体構造を解明した。
• 膜たんぱく質が柔軟に立体構造を変化させて、特定の糖分子を選択的に細胞内に取り込む仕組みが分かった。
• 肥満やがんを抑制する薬剤の分子設計などにつながる基盤情報が得られた。

＜研究の背景と経緯＞
　 清涼飲料水や菓子類、加工食品、ファーストフード、化学調味料などに多く含まれる果糖（フルクトース）の過剰摂取は、肥満・メタボリックシンドローム（内臓脂肪症候群）や脂肪肝など多くの生活習慣病につながる隠れた危険因子です。このことは高果糖のコーンシロップ（高果糖ブドウ糖液糖）を大量に消費する米国ではすでに大きな問題になっており、果糖の摂り過ぎの注意を促す臨床研究が相次いで報告されています。
　生体内に果糖が取り込まれる際の関門になっているのが、ＧＬＵＴ５という膜たんぱく質です。ＧＬＵＴ５は腸管上皮細胞の頭頂面に局在し、摂取した食物から果糖を選択的に吸収する働きを持っています。また、最近の研究結果から、ＧＬＵＴ５は乳がん細胞で過剰発現していることも明らかになり、がん細胞の増殖に深く関与することも知られています。ＧＬＵＴ５を含むＧＬＵＴの分子機構（動く仕組み）や基質認識の特異性を明らかにすることにより、細胞内の糖濃度の調節、ひいては糖尿病、生活習慣病やがんの予防・改善に役立つ新たな知見が得られると期待されており、その基盤情報となる立体構造の解析が望まれています。
　２０年以上にわたり世界中の多数の研究グループがＧＬＵＴの立体構造解析に挑戦し、昨年、初めてブドウ糖（グルコース）を選択的に輸送するヒトＧＬＵＴ１の内開き状態の立体構造が解明されました。しかし、たった１つの立体構造からでは、ＧＬＵＴがどのように糖分子と結合し細胞内に糖分子を輸送させるのか、糖分子を輸送するためにＧＬＵＴがどのように構造を変化させるのかという仕組みは明らかにできませんでした。
　本研究グループでは、ヒトのＧＬＵＴ５とほぼ同じ配列を持つ哺乳類ＧＬＵＴ５の立体構造解析に平成１９年度から取り組んできましたが、哺乳類の膜たんぱく質の立体構造解析は結晶化が非常に難しく、解析に成功していませんでした。しかし本研究グループは５年前に、抗体フラグメント（Ｆｖ）を膜たんぱく質の結晶化を促進する因子として用いる独自技術を開発することに成功し、ＧＬＵＴ５の結晶化およびＸ線構造解析に成功しました。

＜研究の内容＞
　 本研究グループは、ＪＳＴ 戦略的創造研究推進事業 ＥＲＡＴＯ「岩田ヒト膜受容体プロジェクト」（平成１７～２２年度）にて開発した抗体を用いた結晶化促進技術により、ラットのＧＬＵＴ５と抗体フラグメントの複合体の結晶化に成功し、その立体構造をSPring-8のBL41XUを用いたX線結晶構造解析により原子レベルで解明しました。得られた立体構造は、ＧＬＵＴ５が細胞外側に向けて開いた状態（以下、「外開き」）であり、細胞外からの果糖の流入・結合を待ち受けている、糖分子の輸送直前の瞬間の構造と考えられます（図１ａ）。また、変異導入^注３）により細胞の内側に向けて開いた状態（以下、「内開き」）で安定化したウシのＧＬＵＴ５の結晶化にも成功し、その立体構造も原子レベルで解明しました。この立体構造は、ＧＬＵＴ５が細胞内に果糖分子を輸送し終えた瞬間の構造と考えられます（図１ｂ）。昨年解明されたヒトＧＬＵＴ１の立体構造とこれらの構造を比較したところ、ラットのＧＬＵＴ５の外開き状態の構造は新規の知見であることが明らかになりました。
　今回解析したＧＬＵＴ５の立体構造は、細胞膜を貫通する６本のヘリックス^注４）の束が２組、Ｖ字型のように配置されて、基質分子の透過経路となる深く大きな「空洞」を形成していました。基質である果糖は結合していませんでしたが、この空洞の最深部に露出しているアミノ酸残基^注５）を生化学実験により詳しく調べたところ、ＧＬＵＴ５の基質である果糖が結合する部位が明らかになりました。また、この部位にあるアミノ酸残基を１つ変更することで、ＧＬＵＴ５が果糖ではなく、ヒトのＧＬＵＴ１のようにブドウ糖に結合しやすくなることが分かりました。これらの結果は、空洞の最深部周辺のアミノ酸残基が、結合する糖の種類を決める役割を担っていることを示しています。
　さらに、外開き状態と内開き状態のＧＬＵＴ５立体構造を重ね合わせて比較したところ、２組の膜貫通ヘリックスの束が大規模に動いて輸送経路の「空洞」を外開きから内開きに変換する仕組みがあること、それに加えていくつかのヘリックスでは局所的に構造が変化し、いったん結合した果糖を細胞外に逃さず効率的に細胞内に送り込むために、２つの「ゲート」が形成される仕組みが明らかになりました（図２）。また、外開き状態の構造ではＶ字型の全体構造の根元部分に複数の塩橋^注６）が形成されているのに対し、内開き状態の構造ではこれらの塩橋が切断されていました。この塩橋の形成に関与しているアミノ酸残基を変えると、果糖のＧＬＵＴ５への結合が弱まることから、この塩橋は外開き状態の構造を安定化させるだけでなく、果糖の結合にも重要な役割を担っていることが示唆されました。
　これらの立体構造の詳細な分析と生化学的な実験結果から、ＧＬＵＴ５は果糖を細胞内に取り入れるために、果糖を輸送するための空洞を外開きから内開きへと単純に開閉するロッカースイッチ機構^注７）ではなく、果糖が結合しやすいように細胞の外側ゲートが開いた状態を維持し、果糖が結合したらそのゲートを閉じ、局所的な構造を変化させた後に細胞の内側ゲートを開けて果糖を細胞内に放出する「ゲートポア機構」を持っていると考えられます（図３、動画）。親水性の低分子化合物を受動的に輸送する、促進拡散型の膜たんぱく質は、ＧＬＵＴ５と同じような機構により細胞外の分子を細胞内に輸送している可能性が示唆されます。

＜今後の展開＞
　ＧＬＵＴ５において果糖が結合する部位の立体構造情報と、果糖を輸送する仕組みが明らかになったことで、ＧＬＵＴ５の輸送活性を阻害する、あるいは調節できる薬剤の探索や分子設計が可能になると考えられます。また、今回明らかになった立体構造をもとに、基質輸送に伴う輸送体の構造変化を計算機上でシミュレーションおよび再現することにより、輸送体の機能や分子機構をより深く理解できるようになると考えられます。本研究グループが開発した抗体フラグメント作製技術により、これまで立体構造解析が難しかった多くの膜たんぱく質の結晶化および構造解析をより迅速に実施できるものと期待されます。

＜参考図＞

＜用語解説＞
注1) ＧＬＵＴ５（グルットファイブ）
　ヒト・哺乳類細胞における細胞膜を介した糖分子の輸送は、ナトリウムイオン（Ｎａ^＋）－ブドウ糖共輸送体（ＳＧＬＴ）による能動的な輸送と、Ｎａ^＋に依存しない促進拡散による糖輸送体（ＧＬＵＴ）による受動的な輸送により行われることが知られている。ＧＬＵＴといわれる糖輸送体は、１４種類の類縁体（ＧＬＵＴ１～１４）が存在し、そのそれぞれの類縁体は特定の組織への局在性や、輸送する糖の種類（基質）が異なる。例えば、ＧＬＵＴ１は細胞内にブドウ糖（グルコース）を輸送する。ＧＬＵＴ５は腸絨毛の腸管上皮細胞頭頂面に局在し、小腸において摂取した食物から果糖（フルクトース）を吸収するために必須の膜たんぱく質である。なお、腸絨毛の頭頂部に局在し、小腸において摂取した食物からのブドウ糖（グルコース）の吸収に必須の膜たんぱく質はＳＧＬＴ１である。

注2) 抗体フラグメント（Ｆｖ）
　抗体を酵素処理や、遺伝子工学的手法を用いて発現させて、抗原に結合できる最小単位にしたもの。

注3) 変異導入
　人為的に現状のアミノ酸配列を異なる配列に置き換えること。

注4) ヘリックス
　たんぱく質の立体構造の一部で、アミノ酸がらせん状に折りたたまれたモチーフのこと。

注5) アミノ酸残基
　 たんぱく質を構成するアミノ酸の一部で、２０種類あるアミノ酸の種類を決定する。たんぱく質と基質と結合するなどの機能を持つ。

注6) 塩橋
　 たんぱく質の中で塩基性のアミノ酸残基（アルギニンやリジン）と酸性のアミノ酸残基（アスパラギン酸、グルタミン酸）の間に働く弱いイオン性相互作用のこと。たんぱく質の立体構造を安定させる。

注7) ロッカースイッチ機構
　 ２組の膜貫通ヘリックスの束が剛体として可動して内開きと外開きの構造を行き来することにより、基質を輸送する仕組みのこと。