大型放射光施設 SPring-8

公開日

2015年12月18日

2015年12月18日
国立研究開発法人日本原子力研究開発機構

発表のポイント
• がん細胞に特異的に細胞死を誘導する抗体^1）（抗がん剤）の立体構造を原子レベルで解明
• この抗がん剤の作用メカニズムの「鍵」となる基本単位の存在を発見
• 研究成果は、より効果の高い抗がん剤開発へ繋がると期待

研究の背景
　生体では、細胞の表面に様々なタンパク質が存在し、細胞の外側で特定の分子と作用することにより、生命現象に関わる様々な信号を細胞の内側に伝えます。このように信号を「受け取る」役割を持つこれらのタンパク質のことを「受容体」と呼びます。がん（腫瘍）細胞の細胞死（アポトーシス）を引き起こす働きをする受容体の１つとして、「腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド受容体（TRAIL-R2）」が知られています。この信号はがん細胞においてのみ伝わることから、TRAIL-R2を標的とした抗がん剤の開発がさかんに行われています。そのうちの１つがKMTR2と呼ばれる抗体（タンパク質の1種）で、この信号をがん細胞に伝えます。
　これまで原子力機構の玉田太郎グループリーダーらは、KMTR2の働きを様々な手法で調べてきました。その結果、KMTR2が、ヒトが持つTRAIL-R2（ヒトTRAIL-R2）を数多く会合させることで細胞死の信号を伝えることを明らかにしました。しかしながら、KMTR2がどのような会合状態でヒトTRAIL-R2に作用し、細胞死の信号を伝えるかは全くわかっていませんでした。
　そこで、研究グループは、KMTR2とヒトTRAIL-R2が結合した状態でX線結晶構造解析することで、KMTR2が細胞死を引き起こすメカニズムを明らかにすることを試みました。

研究の内容と着想ポイント
　KMTR2のヒトTRAIL-R2の反応に関わる部分を抜き出して、2つのタンパク質が１：１で結合する複合体（以下、1:1複合体）の結晶を作製しました。得られた結晶に大型放射光施設（SPring-8）の強力なX線を照射し、2.1Å分解能（1オングストロームは100億分の1メートル）という高い分解能（解像度）でその三次元立体構造を決定しました。その結果、KMTR2がヒトTRAIL-R2に結合している様子を詳細に明らかにすることができましたが、この情報だけではKMTR2がどのようにヒトTRAIL-R2を会合し、細胞死の信号を伝えるかを解明することはできませんでした。
　タンパク質は3次元的に規則正しく配列することにより結晶状態を形成しますが、結晶中の規則性に基づいた構造がタンパク質の機能に重要であることを、研究グループはこれまでに実施した研究において実証した実績がありました。そこで、本研究では結晶中の規則性に着目し、1:1複合体は隣の複合体とKMTR2中の軽鎖間を認識し合うことにより2量体（2:2複合体）を形成（図1）しており、この2:2複合体がヒトTRAIL-R2の会合構造の基本単位になっていると考え、その実証を試みました。

着想の実証結果
　2:2複合体は隣り合ったKMTR2軽鎖中のアスパラギン（Asn53）というアミノ酸とアルギニン（Arg54）というアミノ酸が認識しあうことで形成されていました（図1右）。このため、この認識を解消すれば2:2複合体の会合構造は形成されないと考え、Asn53をプラスの電荷を有し、かつ嵩高いアミノ酸であるアルギニン（Arg53）に置換した変異体（LkN53R）を作製しました。

　複合体の会合状態をゲルろ過クロマトグラム（分子量の大きさを解析できる手法）で確認したところ、Asn53を有する状態のKMTR2では分子量が高い複合体が多く存在しているのに対し、Arg53に置換した後のLkN53Rはそのような複合体は解消されていました（図3）。

　得られた複合体の結合がどの程度であるかを評価した結果、LkN53RのヒトTRAIL-R2への結合の強さはKMTR2とほとんど変わりがないことがわかりました（図4左）。一方で、がん細胞がどの程度死滅しているかを確認したところ、両者の間で大きく違いがありました（図4右）。これにより、KMTR2中の軽鎖間を認識し合うことにより形成された２：２複合体がヒトTRAIL-R2の会合構造の基本単位になって、がん細胞を死滅することを実証しました。

研究の成果と今後の期待
　Ｘ線結晶構造解析により取得した立体構造情報と、それに基づいて作製した変異体を用いた検証を組み合わせることにより、結晶中に見出したKMTR2（Fab領域）とヒトTRAIL-R2（細胞外領域）の２：２複合体を基本単位として、ヒトTRAIL-R2の高度な会合（複数の分子が一定の決まりで結びついた状態）が形成され、KMTR2によるがん細胞の細胞死が引き起こされるという作用メカニズムを原子レベルで初めて明らかにしました（図5）。
　抗体分子は相手分子（抗原）を特異性高く認識するという特性があることから、特定の分子を標的とした療法（分子標的治療）に幅広く用いられています。がん治療においても、副作用の少ない医薬品として数多くの抗体分子が医薬品として臨床応用されています。今回の研究において、原子レベルで明らかにしたKMTR2の作用メカニズムは、より高機能な抗体分子の創製に繋がる知見を含んでおり、より効果の高い抗がん剤の開発に繋がることが期待されます。

【用語説明】
１) 抗体
特定の分子（抗原）を異物として特異的に認識して、生体内から除去する分子（タンパク質）。長いペプチド（重鎖）と短いペプチド（軽鎖）から構成されており、一般的に右図のような「Ｙ」の字で示されます。抗原認識に関与するのは重鎖と軽鎖の両方から構成され、抗体1分子中に2つ存在するFab領域です。

２) アポトーシス
多細胞生物（ヒトなどの高等生物も含まれる）の細胞で見られる細胞死の一種で、個体を良い状態に保つために遺伝子のプログラムどおりに引き起こされる管理・調節された細胞死のことです。

３) Ｘ線結晶構造解析
タンパク質分子の形（立体構造）を詳細に決定する実験方法。タンパク質の単結晶を作製し、Ｘ線を照射することによって、その立体構造を原子レベルで決定することができます。放射光施設では強力なＸ線を利用することが可能で、小さな結晶から高精度の立体構造を決定できます。本研究は、兵庫県播磨科学公園都市にある大型放射光施設SPring-8のビームラインBL41XUを利用して立体構造決定しました。

４) 分子標的治療
ある特定の分子を標的としてその機能を制御することにより治療する療法。抗体分子はその高い抗原認識特異性から分子標的治療に多く用いられています。特にがん治療においては、さまざまな抗体が医薬品として臨床応用されており、進行・再発の大腸がん治療におけるベバシズマブ（商品名アバスチン）、乳がん治療におけるトラスツズマブ（商品名ハーセプチン）は、世界の医薬品売り上げのトップ10に入っています。